การศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของสารกลุ่มโพลีฟีนอลในสารสกัดที่เป็นน้ำ, เอทานอล, อะซีโตไนไตรล์ ของสมุนไพรต

การศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของสารกลุ่มโพลีฟีนอลใน

สารสกัดที่เป็นน้ำ,เอทานอล, อะซีโตไนไตรล์

ของสมุนไพรตรีผลา ด้วยเทคนิค HPLC

ชื่อผู้เขียน นายสาธิต อินต๊ะ
ชื่อปริญญา วิทยาศาสตรบัณฑิต (รังสีเทคนิค)

อาจารย์ที่ปรึกษา อาจารย์ ดร.วินิจ ช้อยประเสริฐ

บทคัดย่อ

ตรีผลาเป็นยาสมุนไพรที่มีส่วนผสมของ สมอไทย, สมอพิเภก ,และมะขามป้อม เป็นยาแผนโบราณที่มีสรรพคุณช่วยรักษาความสมดุลธาตุทั้ง ๔ ของร่างกายสามารถล้างพิษออกจากระบบต่างๆ ของร่างกาย โดยเฉพาะระบบทางเดินอาหาร ระบบเลือดและระบบน้ำเหลือง ช่วยในการต้านอนุมูลอิสระ ยับยั้งการเกิดสารก่อมะเร็ง ช่วยป้องกันและบำบัดรักษาโรคที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันอาทิเช่น หวัด วัณโรค และเอดส์ ซึ่งผลในการต้านอนุมูลอิสระนั้นมาจากที่ในตรีผลานั้นมีสารพวกฟลาโวนอยด์ซึ่งเป็นสารพวกโพลีฟีนอลอยู่ ในภาคนิพนธ์นี้ได้ทำการศึกษาหาองค์ประกอบทางเคมีของสารกลุ่มโพลีฟีนอลซึ่งส่วนใหญ่เป็นสารพวก ฟลาโวนอยด์ ในสมุนไพรตรีผลาทั้งในสมอไทย สมอพิเภก และมะขามป้อม ด้วยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ซึ่งสามารถแยกสารประกอบออกมาในรูป spectrum แล้วจึงนำ spectrum ที่ได้ไปวิเคราะห์หาพื้นที่ใต้กราฟในสมอไทย สมอพิเภก และมะขามป้อม

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

บทนำ

ตรีผลา (Triphala)
วงการแพทย์แผนไทยและแพทย์อายุรเวทอินเดีย เป็นยาสมุนไพรที่มีส่วนผสมของ ลูกสมอไทย ลูกสมอพิเภกและมะขามป้อม วงการแพทย์แผนไทยและแพทย์อายุรเวทอินเดีย รู้จักยาสมุนไพรตำรับนี้ มาตั้งแต่ครั้งโบราณเป็นยาที่มีสรรพคุณช่วยรักษาความสมดุลธาตุทั้ง ๔ ของร่างกายสามารถล้างพิษออกจากระบบต่างๆ ของร่างกาย โดยเฉพาะระบบทางเดินอาหาร ระบบเลือดและระบบน้ำเหลือง และเป็นยาที่ปลอดภัยไร้ ผลข้างเคียงใดๆคัมภีร์วรโยคสารของแพทย์แผนไทย ได้กล่าวไว้ชัดเจนว่าตรีผลาเป็นยาสำหรับลดความอ้วนเพราะเป็นยาที่สามารถลดมวลของร่างกายได้ คือทำหน้าที่เป็นยาระบายและลดการดูดซึมไขมันเข้าสู่ร่างกายโดยที่ร่างกายไม่สูญเสียน้ำและ สารอาหารจนเกิดอันตราย โดยคำว่าตรี มีความหมายว่า สาม ตามจำนวนของสมุนไพรที่ใช้ประกอบเป็นตำรับยา และผลา หมายถึง ผล ดังนั้น ตรีผลา จึงประกอบด้วยผลของสมุนไพร 3 ชนิด คือ สมอไทย สมอพิเภก และมะข้ามป้อม ซึ่งสมุนไพรแต่ละตัวมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และต้านการอักเสบ เมื่อนำมารวมกันก็จะมีฤทธ์การทำงานที่เสริมกัน ควบคุมพิษข้างเคียงของกันและกัน เช่น รสเปรี้ยว ซึ่งมีฤทธิ์ระบายของลูกสมอพิเภก อาจทำให้เกิดอาการมวนท้องจึงต้องใช้ลูกสมอไทยและลูกมะขามป้อม ซึ่งมีรสฝาดและขม ช่วยแก้ลมจุกเสียด และลดอาการมวนท้อง เป็นต้น ในขณะเดียวกัน ก็ช่วยเสริมฤทธิ์ระบายโดยไม่เป็นอันตราย เพราะยาตำรับนี้เป็นยาที่ควบคุมการถ่ายและการหยุดถ่ายโดยอัตโนมัติ ป้องกันมิให้ร่างกายอ่อนเพลีย ใช้ได้ทุกเพศทุกวัยตั้งแต่เด็กเล็กจนถึงคนเฒ่าชรา ปัจจุบันนี้ตำรับยาตรีผลาเป็นที่นิยมอย่างมากในประเทศสหรัฐอเมริกาในการรับประทานเพื่อล้างพิษและลดน้ำหนัก เพราะตัวยาจะช่วยควบคุมน้ำหนักได้ดี และช่วยระบายไขมันออกมาพร้อมการขับถ่ายเป็นปกติ เพราะใช้ในรูปแบบตำรับไม่ใช้ตัวใดตัวหนึ่ง และตัวยายังทำหน้าที่รู้ถ่ายรู้ปิด คือ ทำหน้าที่ขับระบาย และยังทำหน้าที่หยุดถ่ายระบายอย่างรู้จังหวะเวลา โดยตรีผลาประกอบด้วย

มะขามป้อม

รูปที่ 1 แสดงมะขามป้อม

มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Phyllanthus emblica Linn. จัดอยู่ในวงศ์ EUPHORBIACEAE เป็นไม้ยืนต้นขนาดกลางมีถิ่นกำเนิดแถบเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ และพบได้ในป่าเบญจพรรณแล้งมีลักษณะกลม มีรอยแยกแบ่งออกเป็น ๖ กลีบ เส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ ๒ ซ.ม.ผิวนอกขรุขระมีสีน้ำตาล ส่วนหัวมีรอยขั้วก้านผล เนื้อผลเหนียวแตกยากเนื้อในมีสีเหลืองอ่อน มีเมล็ดสีน้ำตาลอยู่ภายในผลแห้งที่ดีควรมีขนาดใหญ่ อวบอิ่มและแห้งไม่มีก้านผลติดมานิยมใช้ผลแก่ซึ่งมีรสเปรี้ยว ฝาดขม เป็นยาแก้ไอ แก้เสมหะทำให้ชุ่มคอปัจจุบันยังพบว่ามะขามป้อมมีวิตามินซีสูงมาก แก้พิษสารตะกั่วได้ตามตำรับยาแผนโบราณใช้เปลือกลำต้น โดยใช้เปลือกที่แห้งแล้วบดให้เป็นผงละเอียดโรยแก้บาดแผลเลือดออกและแผลฟกช้ำใช้ใบสดมาต้มกินแก้บวมน้ำ นำใบมาตำพอกหรือทาบริเวณแผล ผื่นคันมีน้ำหนองน้ำเหลืองและผิวหนังอักเสบใช้ผลสดเป็นยาบำรุงทำให้สดชื่น แก้กระหายน้ำ แก้ไอแก้หวัด ช่วยระบายขับปัสสาวะ แก้เลือดออกตามไรฟันและคอแห้ง ผลแห้งตำให้เป็นผงชงกินแก้โรคหนองใน แก้ตกเลือด ท้องเสีย โรคบิดแก้โรคดีซ่านและโรคโลหิตจาง

สมอพิเภก

รูปที่ 2 แสดงสมอพิเภก

มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Terminalia belerica (Gaertn.) Roxb. จัดอยู่ในวงศ์ COMBRETACEAE เป็นไม้ผลัดใบมีตั้งแต่ขนาดกลางจนถึงขนาดใหญ่ ผลมีลักษณะเป็นรูปแบบผลมะละกอตรงกลางค่อนข้างจะป่องมีขนาดกว้างประมาณ ๑.๕ - ๒ ซ.ม. ยาว ๒.๕ - ๓ ซ.ม. มีอยู่๕ เหลี่ยม ผิวนอกเป็นขนสีน้ำตาลปกคลุมหนาทึบ ส่วนที่นิยมใช้เป็นยาคือผลแก่มีรสเปรี้ยว ฝาดหวาน เป็นยาระบาย บำรุงธาตุ แก้เสมหะจุกคอ แก้โรคตาแก้ไข้ แก้ริดสีดวงทวาร ผลห่าม ของสมอพิเภกนั้น มีน้ำมันที่ออกฤทธิ์คล้ายน้ำมันระหุ่ง เป็นยาระบาย ส่วนผลสุกมีสารสำคัญ ที่กระตุ้นการหลั่งน้ำดีช่วยทำให้ระบบย่อยอาหาร การทำงานได้ดีขึ้น

สมอไทย

รูปที่ 3 แสดงสมอไทย

มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Terminalia chebula Retz. จัดอยู่ในวงศ์ COMBRETACEAE ใช้เป็นยาสมาน แก้ลมจุกเสียด ยาเจริญอาหาร ยาบำรุงเป็นยาชง-อมกลั้วคอ แก้เจ็บคอ ใช้ภายนอก-บดเป็นผงละเอียดโรยแผลเรื้อรังลดอาการไอแก้อาการแพ้ หืด และไซนัสเรื้อรัง ขับน้ำเหลืองเสีย เป็นยาระบายอ่อนๆแก้พิษร้อนภายใน แก้ลมป่วง ระบายลม รู้ถ่ายรู้ปิดเอง คุมธาตุในตัวเสร็จ ถ่ายพิษไข้ บำรุงสุขภาพ และซ่อมแซมส่วนที่สึกหรอของร่างกายในประเทศอินเดียสารสกัดจากสมอไทยใช้ในการรักษาโรคหลายชนิด เช่น โรคระบบทางเดินอาหารอาการอาหารไม่ย่อย โรคระบบทางเดินปัสสาวะ โรคเบาหวาน โรคผิวหนัง โรคพยาธิ โรคหัวใจ อาการไข้เป็นระยะ อาการท้องอืด ท้องเฟ้อ ท้องผูกแผลในทางเดินอาหาร อาเจียน อาการเจ็บปวดในลำไส้และริดสีดวงทวารหนักนอกจากนี้ยังมีฤทธิ์ในการต้านเชื้อไวรัสและแบคทีเรียบางชนิด บำรุงหัวใจ ต้านอนุมูลอิสระและชะลอความชรา นอกจากนี้ยังช่วยควบคุมระดับไขมันในเส้นเลือดและช่วยการทำงานของตับในการำจัดไขมันออกจากร่างกาย รวมทั้งกระตุ้นการเผาผลาญของร่างกายได้อีกด้วยรสฝาดๆเปรี้ยวๆน้ำหนัก เพียง ๑๐๐ กรัมจะมีปริมาณสารอาหารที่ให้พลังงานต่อร่างกายถึง ๓๗๘ กิโลแคลลอรี่

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

โพลิฟีนอล (Polyphenols)
โพลิฟีนอล (polyphenol) เป็นสารในกลุ่มสารประกอบฟีนอล (phenolic compounds) มีสูตรโครงสร้างทางเคมีเป็นวงแหวนแอโรแมติก (aromatic ring) ที่มีจำนวนหมู่ไฮดรอกซิล (hydroxyl group) รวมอยู่ในโมเลกุล ตั้งแต่ 2 วงขึ้นไป

โพลิฟีนอลส่วนใหญ่เป็นสารในกลุ่มฟลาโวนอยด์ (Flavonoids) ฟลาโวนอยด์เป็น secondary metabolite ที่แบ่งได้ 6 กลุ่มคือ Flavones, flavanones, isoflavones, flavonols, flavanols และ anthocyanins โครงสร้างพื้นฐานของฟลาโวนอยด์ประกอบด้วยวงแหวน A, B และ C ดังรูป 2-3กลุ่ม

รูปที่ 4 แสดงโครงสร้างพื้นฐานของโพลิฟีนอล

โพลีฟีนอล (Pholyphenols) เป็นโภชนเภสัช มีคุณสมบัติที่ดีต่อสุขภาพคือ

ต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant)
ต้านมะเร็ง
ลดความเสี่ยงการเกิดโรคหัวใจ โดยลดระดับของ cholesterol และ triglyceride ในเลือด กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน สามารถช่วยลดการเกิด oxidation ของ low-density lipoprotein (LDL) cholesterol ซึ่งจะช่วยลดความเสี่ยงในการเกิดโรคหัวใจ นอกจากนี้ยังพบว่าชาเขียวสามารถช่วยลดปริมาณ LDL, very low-density lipoprotein (VLDL) และ triglyceride และยังช่วยเพิ่มปริมาณ high-density lipoproteins (HDL) ในกระแสเลือด ซึ่งการมีปริมาณ triglyceride ต่ำ และ HDL สูงนี้สะท้อนถึงสุขภาพของระบบหัวใจที่ดี
ความคุมความดันโลหิตสูง โดยไปยับยั้ง angiotensis-I converting enzyme (ACE)
คุณสมบัติต้านโรคอ้วน : Polyphenols สามารถยับยั้ง catechol-O-methyl transferase จึงช่วยกระตุ้นการสร้างความร้อนของร่างกาย ซึ่งช่วยเผาผลาญพลังงานและช่วยการจัดการกับโรคอ้วน ทั้งยังมีคุณสมบัติในการชะลอการปล่อย glucose สู่กระแสเลือด ดังที่กล่าวมาแล้วในเรื่องคุณสมบัติต้านโรคเบาหวาน ซึ่งทำให้ชะลอการสร้าง insulin ซึ่งเป็น hormone ที่ส่งเสริมให้ร่างกายสะสมไขมัน ดังนั้น ร่างกายจึงเผาผลาญไขมันแทนที่จะสะสมไขมัน
คุณสมบัติต้านโรคเบาหวาน : การศึกษาในหนูทดลอง พบว่า polyphenols สามารถลดระดับน้ำตาลในเลือดของหนูที่เป็นเบาหวาน polyphenols ลดระดับน้ำตาลในเลือดโดยยับยั้งการทำงานของ amylase ซึ่งเป็นเอนไซม์ย่อยแป้ง polyphenols ยับยั้งการทำงานของ amylase ทั้งในน้ำลายและลำไส้ ซึ่งผลที่เกิดขึ้นคือ แป้งจะถูกย่อยช้าลง ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของน้ำตาลในเลือดเป็นไปอย่างช้าๆ นอกจากนั้นชาเขียวยังลดการดูดซึมของกลูโคสที่ลำไส้
คุณสมบัติป้องกันฟันผุ : Polyphenols ช่วยยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในช่องปาก ซึ่งมีทั้งแบคทีเรียที่ก่อโรคในช่องปาก Porphyromonas gingivilis และ แบคทีเรียที่ทำให้ฟันผุ Stretococcus mutans นอกจากนั้นการที่ polyphenols ยับยั้งการทำงานของamylase ในน้ำลาย ช่วยให้การผลิตกลูโคสและมอลโตสน้อยลง ลดปริมาณอาหารของแบคทีเรียที่ทำให้เกิดฟันผุ นอกจากนี้ยังช่วยให้เคลือบฟันแข็งแรงต้านทานการผุ
คุณสมบัติต้านจุลินทรีย์ : Polyphenols มีคุณสมบัติในการต้านแบคทีเรีย เชื่อกันว่า polyphenols ทำลายเยื่อหุ้ม cell ของแบคทีเรีย การดื่มชาสามารถใช้รักษาโรคท้องร่วง catechins สามารถฆ่าสปอร์ของแบคทีเรีย Clostridium botulinum ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคอาหารเป็นพิษ และยังสามารถฆ่าแบคทีเรียที่ทนความร้อน (thermophile) บางชนิด เช่น Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus และ Clostridium perfringens

ฟลาโวนอยด์(Flavonoids)

ฟลาโวนอยด์ (flavonoid) จัดเป็นสารประกอบในกลุ่มโพลีฟีนอล (polyphenolic compounds) และสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ที่พบได้ในธรรมชาติมีมากกว่า 4,000 ชนิด โดยมีโครงสร้างพื้นฐานเป็นฟีนิลเบนโซไพโรน (phenylbenzopyrone) ซึ่งสามารถแบ่งเป็นกลุ่มย่อยตามโครงสร้างเคมีได้ 7 กลุ่ม ได้แก่ ฟลาโวนอล (flavonols) ฟลาโวน (flavones) ฟลาวาโนน (flavanones) ฟลาวานอล (flavanols) ฟลาวาโนนอล (flavanonols) ไอโซฟลาโวน (isoflavones) และแอนโธไซยานิดิน (anthocyanidins) ฟลาโวนอยด์สามารถพบได้ในพืช เช่น ผัก ผลไม้ และเครื่องดื่มบางชนิดเช่น ไวน์ ชา เป็นต้น ดังนั้น ฟลาโวนอยด์จึงเป็นส่วนประกอบซึ่งอยู่ในอาหารที่เรารับประทานในชีวิตประจำวัน รวมถึงพืชสมุนไพรที่ใช้ในตำราแพทย์แผนโบราณ มีคุณสมบัติเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant) ช่วยลดระดับโคเลสเตอรอลในกระแสเลือด ช่วยให้เม็ดเลือดไม่จับตัวเป็นก้อนจนอุดตัน ป้องกันการเกิดมะเร็ง เป็นสารต้านจุลินทรีย์ นอกจากนี้ยังเป็นสารต้านอาการแพ้ ต้านไวรัส ต้านการอักเสบ แต่สิ่งที่น่าสนใจมากที่สุดคือคุณสมบัติในการเป็นสารแอนติออกซิเดนท์ โดยสารฟลาโวนอยด์ (flavonoid) มีความสามารถในการลดการเกิดอนุมูลอิสระ หรือหากเกิดมีอนุมูลอิสระเกิดขึ้นแล้วฟลาโวนอยด์ก็สามารถกำจัดได้

Flavonoids เป็นสารประกอบกลุ่มพอลิฟีนอล ซึ่งประกอบด้วยวงอะโรมาติกตั้งแต่ 2 วงขึ้นไป โดยมีการจับกับคาร์บอนและ aromatic hydroxyl

รูปที่ 5 แสดงโครงสร้างและรูปแบบทั่วไปของ flavonoids ในอาหาร

สารประกอบ flavonoid อาจเรียกได้ว่าเป็นสาร nutraceutical ซึ่งหมายถึงอาหารหรือองค์ประกอบของอาหารที่สามารถนำมาใช้เป็นยาหรือมีประโยชน์ต่อสุขภาพ ทั้งในด้านการป้องกันและการรักษาโรค โดยมีประโยชน์ดังนี้ คือ

- สาร antioxidant พบว่ากลุ่มของสารประกอบ flavonoid ส่วนใหญ่มีคุณสมบัติเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ เช่น สาร flavone และ catechin สามารถช่วยป้องกันการถูกทำลายของเซลล์และเนื้อเยื่อร่างกายจากอนุมูลอิสระและออกซิเจนอิสระ (reactive oxygen species, ROS)

- สาร antimicrobial เช่น สาร Quercetin มีคุณสมบัติเป็น antibacterial สาร Nobiletin, Langeritin และ Hesperidin มีคุณสมบัติเป็น antifungal

- สาร antiviral เช่น สาร Quercetin, Morin, Rutin, Dihydroquercetin, Apigenin, Catechin และ Hespiridine ช่วยในการต้านทานไวรัสได้ 11 ชนิด

- สาร anti-inflammatory เช่น สาร Kaempeferol, quercetin, myricetin และ fisetin

- สาร antidiabetic ได้แก่ สาร Quescetin โดยพบว่าช่วยกระตุ้นการหลั่งฮอร์โมนอินซูลินและเพิ่มประสิทธิภาพในการดูดซึมแคลเซียมซึ่งมีประโยน์ต่อผู้ป่วยโรคเบาหวานชนิดที่ 2

- ผลต่อระบบไหลเวียนโลหิต พบว่าการได้รับสาร flavonoid จะช่วยป้องกันโรคหลอดเลือดหัวใจ โรคความดันโลหิตสูง ภาวะการมีไขมันในเลือดสูงและหลอดเลือดแดงแข็งตัว การแข็งตัวของเลือด

ฟลาโวนอยด์ (flavonoid) สามารถละลายในน้ำได้ ส่วนใหญ่มักพบอยู่รวมกับน้ำตาล ในรูปของสารประกอบไกลโคไซด์ (glycoside) สารประกอบ flavonoids ได้แก่ flavonol, flavonone, flavone, isoflavone, flavonol catechin และ anthocyanins

รูปที่ 6 แสดงโครงสร้างอนุพันธ์ของฟลาโวนอยด์

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

HPLC ( High Performance Liquid Chromatography )

รูปที่ 7 แสดงหลักการทำงานของเครื่อง HPLC

หลักการทำงาน

เครื่อง HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) เป็นเครื่องมือใช้สำหรับแยกสารประกอบที่สนใจที่ผสมอยู่ในตัวอย่าง โดยกระบวนการแยกสารประกอบที่สนใจจะเกิดขึ้นระหว่างเฟส 2 เฟส คือ เฟสอยู่กับที่ ( column ) กับ เฟสเคลื่อนที่ ( mobile phase ) ซึ่งสารจะถูกแยกออกมาในเวลาที่ต่างกัน โดยสารผสมที่อยู่ในตัวอย่างสามารถถูกแยกออกจากกันได้นั้น ขึ้นอยู่กับความสามารถในการเข้ากันได้ดีของสารนั้นกับ mobile phase หรือ stationary phase สารประกอบตัวไหนที่สามารถเข้ากันได้ดีกับ mobile phase จะเคลื่อนที่ผ่าน column ได้เร็วสารนั้นก็จะถูกแยกออกมาก่อน ส่วนสารที่เข้ากันได้ไม่ดีกับ mobile phase หรือเข้ากันได้ดีกับ stationary phase จะเคลื่อนที่ผ่าน column ได้ช้า ก็จะถูกแยกออกมาทีหลัง โดยสารที่ถูกแยกออกมาได้นี้จะถูกตรวจวัดสัญญาณด้วยตัวตรวจวัด สัญญาณที่บันทึกได้จากตัวตรวจวัดจะมีลักษณะเป็นพีค ซึ่งจะเรียกว่า โครมาโตแกรมโดย HPLC สามารถทดสอบได้ทั้งเชิงคุณภาพ และทดสอบเชิงปริมาณ โดยการเปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน

รูปที่ 8 แสดงส่วนประกอบของเครื่อง HPLC

ส่วนประกอบหลักของเครื่อง HPLC

1. Mobile phase / Solvent : หรือตัวทำละลายที่ใช้ในการชะหรือแยกตัวอย่าง เป็นเฟสเคลื่อนที่ มีลักษณะเป็นของเหลว ทำหน้าที่ในการนำสารตัวอย่างและตัวทำละลายเข้าสู่ stationary phase เพื่อให้เกิดกระบวนการแยกภายในคอลัมน์

2. Degaser : ทำหน้าที่กำจัดฟองอากาศ อากาศที่มีอยู่ใน mobile phase เพื่อไม่ให้ฟองอากาศเข้าสู่ column และ detector

3. Pump : ทำหน้าที่ดึงตัวทำละลาย ( mobile phase ) เข้าสู่ระบบ HPLC

4. Injector / Autosampler : ทำหน้าที่ในการฉีดสารตัวอย่างเข้าระบบ HPLC

5. Column : หรือจะเรียกว่า stationary phase มีลักษณะเป็นของแข็งหรือเจล เป็นเฟสอยู่กับที่ ทำหน้าที่ให้เกิดกระบวนการแยกของสารที่สนใจ โดยการบวนการแยกเกิดขึ้นระหว่าง mobile phase กับ stationary phase

6. Detector : คือ ตัวตรวจวัดสัญญาณ ทำหน้าที่ในการตรวจวัดสัญญาณของสารที่สนใจที่ได้จากกระบวนการแยก มีหลายชนิดด้วยกัน การเลือกใช้ขึ้นกับตัวอย่างที่สนใจว่าสามารถตอบสนองกับ Detector ชนิดไหนได้ดี

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

วัตถุประสงค์

1.เพื่อศึกษาหาจำนวนโมเลกุลที่ออกมาจากสมุนไพรตรีผลา ซึ่งได้แก่ สมอไทย สมอพิเภก และมะข้ามป้อม

วัสดุอุปกรณ์และวิธีการศึกษา

อุปกรณ์และสารเคมี

1) สมอไทยอบแห้ง

2) สมอพิเภกอบแห้ง

3) มะข้ามป้อมอบแห้ง

4) หลอดทดลอง 15, 45 ml

5) Micro-tube

6) Centrifuge

7) Cuvette

8) น้ำ

9) เอทานอล

10) Acetronitrile

11) เมทานอล

12) Syringe และไส้กรอง

13) เครื่อง spectrophotometer

14) เครื่อง HPLC

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

วิธีทำการทดลอง

วิธีทำการศึกษา

1) เตรียมสมุนไพรตรีผลาอบแห้ง ได้แก่ สมอไทย สมอภิเภก และมะข้ามป้อม แล้วนำแต่ละชนิดมาบดให้ละเอียด

2) นำสารทั้ง 3 ชนิดมาชั่งให้ได้ 20 g ละลายใน น้ำ, EtOH, และ Acetronitrile ให้ได้ปริมาตรสุทธิ 40 ml จะได้ ทั้งหมด 9 หลอดทดลอง

3) ละลายทิ้งไว้ 2 ชั่วโมง ในอุณหภูมิห้อง ปล่อยให้สารตกตะกอน

4) นำไป centrifuge 1500 RPM 15 นาที 2 ครั้ง แล้วแยกส่วนที่เป็นของเหลวใส่ micro pipet 2 ml

5) แล้วนำไป centrifuge 7200 RPM 1 ชั่วโมง 2 ครั้ง แล้วแยกส่วนที่เป็นของเหลวใส่ micro pipet 1 ml

6) นำไปละลายในน้ำอัตราส่วน 1:100

7) นำสารที่ได้ไปวัด spectrum ที่เครื่อง spectrophotometer โดยใช้สาร 20 µl และเติมน้ำ 1980 µl ใน cuvette

8) และนำสารทั้ง 9 ไปกรองด้วยไมโครฟิลเตอร์ก่อนนำไปทำ HPLC

9) ฉีดเข้าเครื่อง HPLC ปริมาตรทั้งหมด 60 µl

10) หาพื้นที่ใต้กราฟตาม retention time ของแต่ละโครมาโตแกรม

11) สร้างตารางแสดงจำนวนโมเลกุลในสมอไทย สมอพิเภก และมะขามป้อม

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

ผลการศึกษา

การสกัดสารกลุ่มฟลาโนนอยด์จากมะขามป้อม สมอไทยและสมอภิเภก

จากการนำสารสมุนไพรตรีผลาทั้ง 3 มาละลายในน้ำ, เอทานอล, และอะซีโตไนไตรล์ ได้สารในหลอดทดลองทั้งหมด 9 หลอด ได้แก่ มะขามป้อมในน้ำ, มะขามป้อมในเอทานอล, มะขามป้อมในอะซีโตไนไตรล์, สมอพิเภกในน้ำ, สมอพิเภกในเอทานอล, สมอพิเภกในอะซีโตไนไตรล์, สมอไทยในน้ำ, สมอไทยในเอทานอล, และสมอไทยในอะซีโตไนไตรล์ ซึ่งลักษณะสีของสารละลายในมะขามป้อมจะได้สารละลายสีน้ำตาลดำเข้ม ในสมอไทยจะได้สารละลายสีน้ำตาลอ่อน ส่วนในสมอพิเภกจะได้สารละลายสีเหลืองทอง เมื่อนำสารทั้ง 9 หลอดมามาทดสอบดูการดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง Spectrofluorometer จะพบว่าสารทั้ง 3 ที่ละลายในตัวทำละลายที่ต่างกันจะพบแถบการดูดกลืนแสงที่มากสุดที่ 274 nm

แถบการดูดกลืนพลังงานของสารสกัด

รูปที่ 9 แสดงแถบการดูดกลืนแสงของมะขามป้อมที่ผสมในเอทานอลด้วยเครื่อง Spectrofluorometer
พบว่ามีการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นสูงสุดที่ 274 nm

โครมาโตแกรมของสารสกัด

ในการวิเคราะห์ทำได้โดยการแยกกราฟเพื่อคำนวณพื้นที่ใต้กราฟของแต่ละพีคเพื่อแยกสารต่างๆที่ปรากฎตาม retention time ที่ต่างกัน แล้วนำไปสร้างตารางเปรียบเทียบองค์ประกอบทางเคมีด้วยค่า Retention time โดยใช้พื้นที่ใต้กราฟ เพื่อหาองค์ประกอบทางเคมีที่เหมือนและแตกต่างกันของสารแต่ละชนิด

รูปที่ 10 แสดงการแยกกราฟเพื่อหาพื้นที่ใต้กราฟตามเวลา retention time

รูปที่ 11 แสดงโมเลกุลจากสมอไทยที่สกัดด้วยอะซีโตไนไตรล์ในน้ำที่ Rt = 5.8, 6.9, 8.3, 10.9, 12.4, 15.7 นาที ให้สเปกตรัมสูงสุดที่ 254 nm.

จากการทำ HPLC ซึ่งใช้เวลาในการรันทั้งหมด 30 นาที พบว่า มีพีคที่ปรากฏขึ้น 2 ช่วง ในช่วงแรกจะพบสารโมเลกุลเล็กซึ่งเป็นพวก phenolic acid และช่วงที่สองจะปรากฏพีคที่มีปริมาณความเข้มส่วนมากซึ่งในกลุ่มนี่จะเป็นพวก Flavones ซึ่งมีโมเลกุลใหญ่

รูปที่ 12 แสดง Chromatogram ของมะขามป้อมสกัดด้วยเอทานอล ซึ่งแสดง spectrum ของ แต่ละโมเลกุลในโครมาโตแกรม ที่ความยาวคลื่น 254 nm.

ตารางที่ 1 แสดง Retention time ที่มีโมเลกุลออกมาจากสารสกัดด้วยน้ำ เอทานอล และอะซีโตไนไตรล์ ของมะขามป้อม สมอพิเภก และสมอไทย

Rt	มะข้ามป้อม			สมอพิเภก			สมอไทย
Rt	H₂O	EtOH	CH₃CN	H₂O	EtOH	CH₃CN	H₂O	EtOH	CH₃CN
5.8	-	-	-	-	-	-	-	-	3.17
6.5	-	-	-	-	32.55	-	-	-	-
6.9	-	-	-	8.46	-	10.12	-	-	13.04
8.3	-	-	-	-	-	2.25	-	-	1.73
9.3	-	-	-	-	12.43	-	-	-	-
10.9	-	-	-	1.12	-	12.73	-	-	2.19
11.5	-	-	-	0.98	-	-	-	-	-
12.4	-	-	-	-	-	1.27	-	-	0.87
14.7	-	-	34.39	-	-	29.62	-	-	-
15.7	-	-	39.00	-	-	33.22	-	-	64.54
16.1	-	-	-	-	-	-	-	-	-
17.8	-	86.85	21.83	-	46.37	-	-	-	-
18.6	95.18	8.60	-	-	8.63	10.79	-	93.70	14.45
19.7	-	-	-	61.90	-	-	52.61	4.18	-
20.6	4.82	4.55	-	25.09	-	-	-	-	-
21.5	-	-	-	-	-	-	40.57	-	-
23.9	-	-	-	-	-	-	-	2.11	-
25.5	-	-	-	-	-	-	7.32	-	-
26	-	-	-	3.34	-	-	-	-	-

♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖ ♗ ♘ ♙ ♚ ♛ ♜ ♝ ♞ ♟♔ ♕ ♖

อภิปรายผลการศึกษา

ในแยกองค์ประกอบทางเคมีด้วยการทำ HPLC สามารถแยกสารชนิดต่างๆกันได้ ซึ่งสามารถแยกสารที่เป็นอนุพันธ์ในกลุ่มของโพลีฟีนอลได้เมื่อนำไปเทียบกับสารมาตรฐาน

รูปที่ 13 แสดงโครงสร้างเคมีของ Catechin, eriodictyol, apigenin, kaempferol, quercetin
ซึ่งเป็นอนุพันธ์ของกลุ่มโพลีฟีนอล

จากการทดลองในการทำ HPLC ซึ่งใช้เวลาในการรันทั้งหมด 30 นาที พบว่า มีพีคที่ปรากฏขึ้น 2 ช่วง ในช่วงแรกจะพบสารโมเลกุลเล็กซึ่งเป็นพวก phenolic acid และช่วงที่สองจะปรากฏพีคที่มีปริมาณความเข้มส่วนมากซึ่งในกลุ่มนี่จะเป็นพวก Flavones ซึ่งมีโมเลกุลใหญ่ เนื่องจากในการทำ HPCL ซึ่งใช้ colume C-18 Innertsil เป็น stationary phase และใช้ mobile phase เป็นน้ำ 40% และเอทานอล 60% ซึ่งเป็นแบบ reverse phase เมื่อฉีดสารเข้าไปใน colume โดยในการทดลองนี้เป็นระบบ Isocratic elution เป็นการใช้สารละลายที่เหมาะสมเพียงแบบเดียวตลอดการชะ และอาจจะใช้เวลานานในการแยก ซึ่งเมื่อสารผ่าน colume สารที่มีโมเลกุลเล็กจะผ่าน colume ได้ไวกว่าสารที่มีโมเลกุลใหญ่ ทำให้เราเห็นสเปกตรัมของสารโมเลกุลเล็กในช่วงเวลาแรกๆซึ่งเป็นสารประเภท phenolic acid ซึ่งมีโมเลกุลเล็กกว่าพวก Flavones ซึ่งมีโมเลกุลใหญ่ที่พบในช่วงเวลาถัดมา

ใน chromatogram ช่วงแรกของสารบางตัวอาจพบพีคที่มีค่าต่ำซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากการที่ใช้ตัวทำละลายในสารตัวอย่างกับการใช้ตัวชะที่ต่างชนิดกันจึงทำให้ช่วงแรกอาจมีผลของการดูดกลืนแสงจากตัวชะเข้ามาเกี่ยวข้องได้

รูปที่ 14 แสดงผลของ Eluent ที่พบช่วง Retention time แรกๆ ในChromatogram ของมะขามป้อมในน้ำ

ใน chromatogram ช่วงแรกของสารบางตัวอาจพบพีคที่มีการเหลื่อมล้ำกัน (Lump peak)อาจมีสาเหตุมาจากการที่ใช้การใช้ตัวชะที่ไม่เหมาะสมจึงทำให้การแยกพีคในช่วงแรกทำได้ยาก

รูปที่ 14 แสดง Lump peak ที่พบช่วง Retention time แรกๆ ในChromatogram ของสมอไทยในน้ำ

สรุปผลการศึกษา

จากการศึกษาพบว่าในสมอพิเภกมีโมเลกุลที่หลากหลายที่สุด ในการสกัดสมอไทยด้วยอะซีโตไนไตรล์จะแยกสารในช่วง Retention time แรกๆได้ดีเมื่อเทียบกับน้ำและเอทานอลที่ปรากฏเป็น lump peak ซึ่งวิเคราะห์ได้ยาก ในขณะที่ Rt=6.9, 8.3, 10.9, 12.4, 18.6 และ 19.7 พบโมเลกุลเดียวกันในสมอพิเภกและสมอไทยในขณะที่ Rt=14.7, 17.8, 18.6, และ 20.6 พบโมเลกุลเดียวกันในสมอพิเภกและมะขามป้อม และเฉพาะใน Rt=18.6 จะพบโมเลกุลเดียวกันนั้นในทั้งสมอไทย, สมอพิเภก, และมะข้ามป้อม

โดยในมะขามป้อมเมื่อสกัดด้วยน้ำจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=18.6 เป็นจำนวน 95.18% เมื่อนำไปสกัดในเอทานอลจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=17.8 เป็นจำนวน 86.85% และเมื่อนำไปสกัดในอะซีโตไนไตรล์จะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=15.7 เป็นจำนวน 39.00%

โดยในสมอพิเภกเมื่อสกัดด้วยน้ำจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=19.7 เป็นจำนวน 61.90% เมื่อนำไปสกัดในเอทานอลจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=17.8 เป็นจำนวน 46.37% และเมื่อนำไปสกัดในอะซีโตไนไตรล์จะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=15.7 เป็นจำนวน 33.22%

โดยในสมอไทยเมื่อสกัดด้วยน้ำจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=19.7 เป็นจำนวน 52.61% เมื่อนำไปสกัดในเอทานอลจะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=18.6เป็นจำนวน 93.70% และเมื่อนำไปสกัดในอะซีโตไนไตรล์จะมีองค์ประกอบหลักที่ Rt=15.7 เป็นจำนวน 64.54%

แหล่งอ้างอิง

http://www.teainstitutemfu.com/article/chemistry.html
http://share.psu.ac.th/blog/science-equipment/945
http://www.gpo.or.th/rdi/html/hplc.html
http://www.kmitl.ac.th/sisc/HPLC/Theory.htm
http://antioxidantherb.blogspot.com/2011/07/flavonoid.html
http://tuvayanon.net/6b5308081951.html
http://www.greenclinic.in.th/triphala.html
http://www.xn--m3couj9dp.net/
http://www.thaipost.net/node/55146
http://tripala.weebly.com/

วันจันทร์ที่ 17 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2557